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Cellsorter亞納升精密壓電吸管用于單細(xì)胞分離和液滴打印

更新時(shí)間:2022-01-10 點(diǎn)擊量:6278

 

盡管使用手持式移液管處理微升級(jí)液體是一項(xiàng)常規(guī)任務(wù),但由于表面張力、粘附力和蒸發(fā)效應(yīng)等技術(shù)難題,移液納升級(jí)體積具有挑戰(zhàn)性。Cellsorter開(kāi)發(fā)了一種全自動(dòng)壓電微移液管,精度<1納升,將基于成像的單細(xì)胞分離效率提高到90%以上。這一改進(jìn)在分離稀有或珍貴細(xì)胞時(shí)至關(guān)重要,尤其是在醫(yī)療應(yīng)用中。緊湊的壓電微移液管可以集成到各種(生物)化學(xué)工作流程中。它消除了塑料管、閥門(mén)、注射器和壓力罐對(duì)于樣品的高質(zhì)量相襯照明,例如細(xì)胞或微小液滴.Cellsorter構(gòu)建了與微移液管同心排列的LED環(huán)。同樣的裝置可以在顯微鏡上使用熒光或透明照明,方便地用于試劑的單細(xì)胞打印和納升級(jí)液滴打印。Cellsorter設(shè)想這項(xiàng)新技術(shù)不久將成為醫(yī)學(xué)診斷中單細(xì)胞操作的標(biāo)準(zhǔn)工具,例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離。

在實(shí)驗(yàn)室中,毫升(ml)或微升(μl)刻度的液體處理是一項(xiàng)常規(guī)任務(wù),例如,使用手持移液管。然而,0.1μl以下的處理量是一個(gè)挑戰(zhàn)。如果液滴的尺寸小于毛細(xì)管長(zhǎng)度,則微小液滴的動(dòng)力學(xué)主要取決于重力作用下的表面張力。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)溫度和壓力下的水和空氣界面,毛細(xì)管長(zhǎng)度約為2 mm。小液滴與移液管固體表面之間的粘附力在該長(zhǎng)度范圍內(nèi)也至關(guān)重要。小水滴的快速蒸發(fā)是另一個(gè)困難。在流體系統(tǒng)中,密封將流體保持在管道或通道內(nèi)。在大多數(shù)情況下,密封件由軟彈性材料制成:各種橡膠或PTFE。由于流體部分被彈性材料包圍,因此在微觀尺度上控制其體積很麻煩。然而,當(dāng)試劑的體積受到限制時(shí),例如在單細(xì)胞測(cè)量中,納升(nl)或皮升(pl)級(jí)液體處理是一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)。

微流控芯片處理微小體積流體的簡(jiǎn)單解決方案是使用具有微米大小通道的微流控芯片來(lái)傳導(dǎo)水溶液。將微流體集成到復(fù)雜芯片中是非常有前景的,其主要目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)芯片上實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)。基于液滴的微流體(Guo等人2012;K?ster等人2008;Agresti等人2010;Brouzes等人2009;Leung等人2012)處理懸浮在石油環(huán)境中的亞納米級(jí)水滴。然而,目前可用的微流體存在許多技術(shù)缺陷(Leung等人,2012年)。這些芯片對(duì)介質(zhì)的固體污染非常敏感。需要使用含有適當(dāng)表面活性劑的特殊且昂貴的油來(lái)維持穩(wěn)定的乳液。在大多數(shù)情況下,實(shí)現(xiàn)流量的適當(dāng)穩(wěn)定性是一項(xiàng)挑戰(zhàn),更不用說(shuō)在試驗(yàn)前和試驗(yàn)后的瞬態(tài)效應(yīng)了, 液滴內(nèi)捕獲的單個(gè)細(xì)胞可以單獨(dú)進(jìn)行DNA條形碼編碼、匯集和隨后測(cè)序(Lee等人,2016年)。然而,在這個(gè)過(guò)程中,單個(gè)細(xì)胞的表型信息丟失了。因此,DNA/RNA序列不能與腫瘤或發(fā)育組織中特定細(xì)胞的作用相關(guān)。

壓電液滴系統(tǒng)可以通過(guò)微移液管注入nl或pl大小的液滴(www/scienion/com/; www/cytena/com)。注射器中的壓電致動(dòng)器產(chǎn)生壓力波,從毛細(xì)管中注入液滴。注射器不能像手持式移液管一樣在同一周期內(nèi)抽取和沉積小體積的液體。此解決方案僅在空氣中有效。壓電注射器機(jī)器人可用于打印,但不能用于流體的pl–nl 級(jí)采樣。

使用玻璃微移液管的微注射器和FluidFM微注射/精確到飛秒級(jí)是細(xì)胞生物學(xué)中一項(xiàng)眾/所/周/知的技術(shù)(Takagi et al.2007)。也可以使用微流控原子力顯微鏡(FluidFM)進(jìn)行微注射(Meister等人,2009年)。但是,微型噴射器不能以高精度拉動(dòng)和噴射相同的流體。由于長(zhǎng),宏觀彈性管和密封,當(dāng)他們拔出液體后開(kāi)始注射時(shí),這些設(shè)備工作時(shí)有很大的滯后.

SODA機(jī)器人——機(jī)器人(Zhu等人,2013年)使用由注射泵控制的1μl Hamilton注射器,并連接到帶有1厘米泰貢管的玻璃微量移液管,從而將拉注過(guò)程的誤差降至更低。然而,這種zui/先/進(jìn)的設(shè)置很難常規(guī)應(yīng)用。即使在這個(gè)專(zhuān)門(mén)的系統(tǒng)中,拉和沉積循環(huán)也只能實(shí)現(xiàn)納升精度。SODA機(jī)器人的熱體積波動(dòng)也很明顯。SODA機(jī)器人的另一個(gè)缺點(diǎn)是漢密爾頓注射器和毛細(xì)管之間固有的1厘米短管,導(dǎo)致難以操作的設(shè)置。該裝置的速度受注射泵的速度限制。SODA機(jī)器人的最終精度也受到漢密爾頓注射器和注射泵的限制。

根據(jù)顯微圖像使用微量移液管拾取細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分離是一種成熟的方法(Kurimoto等人,2006年;Hosokawa等人,2009年)。為了提高通量和效率,在過(guò)去幾年中出現(xiàn)了應(yīng)用電動(dòng)顯微鏡和微操作器的半自動(dòng)化技術(shù)(Schneider等人,2008年;Yoshimoto等人,2013年;K?rnyei等人,2013年)。商用微移液管法的液體處理精度受到將微移液管連接至真空罐的長(zhǎng)(~1 m)塑料管的限制(K?rnyei等人,2013年;Salánki等人,2014a;Ungai Salánki等人,2016年)。管的彈性導(dǎo)致納升級(jí)流體流動(dòng)的滯后。微移液管中的流量不僅受壓力罐中的真空或超壓的影響,還受管的彈性膨脹的影響。盡管這一限制可以在研究實(shí)驗(yàn)室處理,以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞RNA測(cè)序(Kozlov等人2017;Ngara等人2018)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)分離(Winter等人2018)的結(jié)果,蛋白質(zhì)工程(Piatkevich et al.2018)或單細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)(Salánki et al.2014b;Sándor et al.2016;Ungai Salánki et al.2019),妨礙了它們?cè)卺t(yī)學(xué)診斷中的常規(guī)應(yīng)用。

盡管如此,閥控射流系統(tǒng)的簡(jiǎn)單性和靈活性仍有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn),包括其應(yīng)用恒定、穩(wěn)定和高真空的能力,以及由此產(chǎn)生的高流體動(dòng)力。如果需要,可將微移液管收集的液體體積設(shè)置為高(幾微升)。這在分離強(qiáng)粘附細(xì)胞或測(cè)量細(xì)胞粘附力時(shí)非常有用。當(dāng)前開(kāi)發(fā)的背景是閥控細(xì)胞分選儀(www/singlecellpicker/com/valve-control)在電動(dòng)顯微鏡上工作。真空罐和超壓罐通過(guò)兩個(gè)高速流體閥與垂直微量移液管相連。在Petri培養(yǎng)皿中掃描樣本并用計(jì)算機(jī)視覺(jué)或手動(dòng)檢測(cè)細(xì)胞后,微移液管通過(guò)打開(kāi)微移液管和真空罐之間的閥門(mén)逐個(gè)拾取所選細(xì)胞。然后,通過(guò)打開(kāi)超壓罐和微量移液管之間的閥門(mén),將單個(gè)細(xì)胞沉積到PCR管中(K?rnyei等人2013;Salánki等人2014a)。

在目前的工作中,Cellsorter優(yōu)化并應(yīng)用了基于微移液管的裝置,以最小化其拾取體積并最大限度地提高其精度。Cellsorter開(kāi)發(fā)了一種全自動(dòng)、緊湊的壓電微移液管,結(jié)合高分辨率成像和<1nl液體處理精度(CellSorter Kft(2019)壓電微移液管PCT專(zhuān)/利申請(qǐng)HU 2019/000002)(www/singlecellpicker/com/piezo-head)。它消除了塑料管、閥門(mén)、注射器和壓力罐的影響。它可以分離敏感或稀有細(xì)胞或效率>90%的細(xì)胞。可用于nl級(jí)液滴打印,包括單細(xì)胞打印

打開(kāi)壓電吸管并將壓電頭固定在顯微鏡(蔡司)上后,校準(zhǔn)壓電致動(dòng)器,cellsorter測(cè)量了壓電致動(dòng)器(PI Ceramic P-885.11)自由端的位移,作為電壓的函數(shù),從0 V開(kāi)始到+100 V,然后從+100 V回到0 V。相鄰測(cè)量點(diǎn)之間的電壓階躍以50ms線(xiàn)性斜坡施加。Cellsorter在每個(gè)施加電壓步驟后捕獲致動(dòng)器的圖像,并將所有圖像與在0 V電壓下捕獲的第一張圖像進(jìn)行比較,以計(jì)算位移。Cellsorter用線(xiàn)性曲線(xiàn)擬合完整數(shù)據(jù):y=0.0727±0.0055[μm/V]x+0.9502μm;R2=0.9008。產(chǎn)生的7.3μm/100 V在供應(yīng)商(PI Ceramic)規(guī)定的范圍內(nèi)

校準(zhǔn)壓電微移液管以量化壓電微移液管的液體處理精度,首先,Cellsorter在疏水35 mm皮氏培養(yǎng)皿(Greiner)中在2 ml礦物油中生成水滴。對(duì)于±50 V(100ms線(xiàn)性斜坡)的較大電壓,使用0.5μl Hamilton注射器沉積約0.1μl水滴。為了測(cè)試±5±10 V(100ms,線(xiàn)性斜坡)的較低電壓,使用內(nèi)徑(內(nèi)徑)為30μm的微移液管,使用1×1 mm2 NBR 70 O形環(huán)和+100 V制備約20 nl水滴。產(chǎn)生液滴后,微移液管靠近培養(yǎng)皿表面,距離液滴內(nèi)部100μm。Cellsorter用10倍或20倍的物鏡測(cè)定水滴體積的變化。Cellsorter將顯微鏡聚焦在液滴底部,并測(cè)量液滴與培養(yǎng)皿之間界面的d1直徑,即液滴中缺失的球形帽的直徑。Cellsorter拍攝了液滴的圖像,并在其輪廓上畫(huà)了一個(gè)圓圈。Cellsorter還測(cè)量了球形液滴的D1直徑(圖1c)。然后Cellsorter施加正或負(fù)電壓階躍。測(cè)量至少重復(fù)三次。Cellsorter再次測(cè)量了液滴底部的d2直徑和球形液滴的d2直徑。Cellsorter根據(jù)d1、d1、d2和d2計(jì)算液滴體積,如下所示:

Vdroplet = Vsphere ? Vspherical cap, where (1)

Vspherical cap = hspherical cap ?π/6(3r2 + h2spherical cap), where(2)

h spherical cap = R1,2 ?√(R21,2?r21,2), where(3)

R 1,2 =D1,2/2, (4)

r1,2 =d1,2/2 (5)

 

Cellsorter用線(xiàn)性函數(shù)擬合測(cè)量數(shù)據(jù)。作為施加電壓階躍ΔU(V)函數(shù)的液滴ΔV(nl)體積變化如下:ΔV=0.21*ΔU? 0.1329; 斜率:0.21±0.08 nl/V,R2=0.9929。

使用內(nèi)徑為30–70μm的微移液管,使用3.5×1.1 mm2 FPM O形環(huán)(超級(jí)密封),通過(guò)在礦物油或氟化油下在35 mm親水塑料培養(yǎng)皿(Greiner)中施加40–100 V(100 ms,線(xiàn)性斜坡)的電壓階躍,沉積油水珠下的納升液滴打印。這些液滴被認(rèn)為是球形帽。為了計(jì)算親水表面上水滴的體積,Cellsorter測(cè)量了幾個(gè)代表性水滴的接觸角(θ):

sin θ= 2hr/(r2 + h2)    (6)

液滴高度(h)與表面上液滴直徑(2r)之比為0.49±0.05,因此θ=82°±5°。然后,Cellsorter只測(cè)量了液滴的(2r)直徑,并計(jì)算了它們的體積,如下所示:

V =πh (3r2 + h2) /6  (7)

where h = 0.98 ? r.

Cellsorter還根據(jù)壓電致動(dòng)器的校準(zhǔn)位移和O型環(huán)的尺寸計(jì)算了移液管的完整(理論)體積Vfull(nl),如下所示:

V  full = 0.0727 ? ΔU ? (RO-ring + rO-ring)2 ?π,(8)

式中,RO環(huán)為O型環(huán)內(nèi)徑的一半,rO環(huán)為O型環(huán)高度的一半

測(cè)量壓電微移液管中的流體流量波動(dòng)Cellsorter使用1×1 mm2 NBR 70 O形環(huán)測(cè)量了內(nèi)徑為30μm的微移液管中的流體流量波動(dòng)。壓電頭包括致動(dòng)器和微量移液管,通過(guò)磁性支架水平固定在配備5×物鏡的顯微鏡上。在內(nèi)徑為1.2mm的玻璃管中填充2μm熒光紅色顆粒(Spherotech)懸浮液,該懸浮液在0.1%Triton-X-100中稀釋至200倍。玻璃管的兩端用一滴礦物油封閉,以防止水懸浮液蒸發(fā)。微量移液管進(jìn)入試管,直到它到達(dá)珠子懸浮液。Cellsorter每隔30秒記錄一次珠子的運(yùn)動(dòng)。Cellsorter在這些間隔內(nèi)對(duì)壓電致動(dòng)器施加正負(fù)電壓階躍,并在顯微鏡上觀察其效果。

粒子跟蹤測(cè)速儀(PTV)和流量計(jì)算Cellsorter使用PTV來(lái)計(jì)算由電壓階躍觸發(fā)或由無(wú)電壓階躍的波動(dòng)驅(qū)動(dòng)的玻璃微移液管中的流量。在每段視頻中,Cellsorter可以跟蹤約20顆珠子。Cellsorter使用免費(fèi)的視頻到JPG轉(zhuǎn)換器將視頻中的幀提取到JPG文件中。Cellsorter使用了TrackMate ImageJ插件(www/imagej/net/Getting_started_with_Track Mate),以分析珠子的軌跡。為了檢測(cè)圖像中的珠子,Cellsorter使用了高斯差分法(DoG檢測(cè)器),這是一種可用于斑點(diǎn)檢測(cè)和跟蹤的特征增強(qiáng)算法。DoG是一種帶通濾波器,用于去除代表噪聲的高頻分量和代表圖像中較大均勻區(qū)域的一些低頻分量。在第一幀中正確檢測(cè)到珠子后,Cellsorter使用簡(jiǎn)單線(xiàn)性分配問(wèn)題(LAP)跟蹤器粒子鏈接算法。Cellsorter將珠子軌跡保存在xml文件中,以便使用MATLAB代碼對(duì)其進(jìn)行分析,以計(jì)算下面描述的數(shù)量。柱面坐標(biāo)系固定在微量移液管的軸上,從微量移液管尖/端測(cè)量軸向坐標(biāo)X,徑向坐標(biāo)R(圖2a)。珠子的徑向位移可以忽略不計(jì)。Cellsorter計(jì)算了軸向位移(圖2d):

圖1壓電微量移液管。帶有彈性管和注射器的標(biāo)準(zhǔn)微量移液管。壓電微移液管的示意圖。頂部的壓電致動(dòng)器被推到尺寸在[1–6]×1 mm范圍內(nèi)的O形圈上。玻璃微移液管通過(guò)垂直通道連接到O形圈的內(nèi)部體積。這些都裝滿(mǎn)了水。相位對(duì)比度照明由與微移液管同心排列的一圈LED提供。c校準(zhǔn)原理。當(dāng)使用1×1 mm2 O形環(huán)向壓電元件施加電壓時(shí),Cellsorter測(cè)量了先前沉積在油下疏水表面上的水滴體積的變化。根據(jù)電壓階躍前后的液滴直徑(D1,D2)和接觸面積直徑(D1,D2),Cellsorter計(jì)算了作為施加電壓函數(shù)的體積變化(補(bǔ)充圖3)。結(jié)果,Cellsorter獲得了斜率為0.21±0.08 nl/V(d)的校準(zhǔn)曲線(xiàn)。e–g納升液滴打印。e使用內(nèi)徑為70μm的移液管(3.5×1.1 mm2 O形圈)在礦物油下打印+75 V(100 ms,線(xiàn)性斜坡)的水滴。根據(jù)[0]中壓電致動(dòng)器f的位移→ 100 V](矩形)和[100→ 在0 V(圓形)范圍內(nèi),Cellsorter計(jì)算了帶有3.5×1.1 mm2 O形環(huán)的移液管的完整體積變化。壓電位移的滯后在0→ + 100→ 0伏航向。打印液滴g的體積非常均勻(補(bǔ)充圖4)。由于水和油之間的表面張力,它低于計(jì)算的移液全體積,并且取決于微移液管的直徑(30、50、70μm)。當(dāng)從微移液管中推出液滴時(shí),由于表面張力,水和油界面處的拉普拉斯壓力與微移液管的直徑成反比。對(duì)于I.D.30、50和70μm微量移液管,Cellsorter能夠成功應(yīng)用于打印液滴的最小電壓分別為80、50和40 V(Cellsorter沒(méi)有在80 V下使用I.D.50和70μm微量移液管)

 

Δx(t) = x(t) ? x(t ?Δt),(9)

平行于微量移液管軸線(xiàn)的珠子。Cellsorter計(jì)算了珠子的軸向速度:

v(t) =Δx(t)/Δt  (10)

圖2壓電微移液管中的流量波動(dòng)。從側(cè)面看微移液管的幾何形狀。Cellsorter測(cè)量了內(nèi)徑為30μm的微量移液管的錐角(α=6.3°)及其孔徑半徑(R0)。圓柱坐標(biāo)系固定在微移液管的軸上,從微移液管尖/端測(cè)量軸向坐標(biāo)X和徑向坐標(biāo)R。微移液管的壁在b中用白色虛線(xiàn)表示。Cellsorter將微移液管放入另一個(gè)直徑為D=1.2 mm的玻璃管中。這個(gè)外管充滿(mǎn)了水,其中含有2μm的熒光珠,在圖像左側(cè)顯示為白點(diǎn)。外管內(nèi)的水相兩端被一滴油堵塞,以避免蒸發(fā)。紅色虛線(xiàn)表示左側(cè)的水和右側(cè)的油之間的界面。當(dāng)微移液管從右側(cè)向內(nèi)推入外管并到達(dá)水相時(shí),微珠進(jìn)入微移液管。Cellsorter跟蹤并分析了移液管(c)中微珠的運(yùn)動(dòng)。d微移液管中六個(gè)選定微珠的位移隨時(shí)間的變化。在5分鐘時(shí)施加+6 V的電壓階躍。Cellsorter根據(jù)微珠位移和微移液管的幾何形狀計(jì)算流速e。從微量移液管流出的流體的計(jì)算體積如f所示(見(jiàn)補(bǔ)充視頻1,2)

由于微珠的密度較低,Cellsorter無(wú)法在移液管中*采樣拋物線(xiàn)速度分布。因此,Cellsorter使用以下公式計(jì)算基于最快胎圈的估計(jì)流量(圖2e):

Q(t) = v(t) ? A(x) (11)

式中,A(x)是特定珠粒位置處微量移液管的橫截面(圖2a):

A(x) = R pipette(x)2 ?π, (12)

R pipette = (x + x0) tgα/2, (13)

x0 =R0/tgα/2  (14)

最后,Cellsorter計(jì)算流量V作為流量Q的時(shí)間積分(圖2f):

ΔV(Δt) =0Δt Q(t)dt. (15)

3T3細(xì)胞培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(ATCC;CCL-92)在補(bǔ)充有10%FCS(Sigma)的MEM中按照ATCC細(xì)胞生物學(xué)收集指南生長(zhǎng)。用親脂性熒光染料DiI(10μM,37℃下30分鐘,體外培養(yǎng))對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行染色。在分選之前,3T3細(xì)胞在37℃下用1×胰/蛋/白酶-EDTA溶液(Gibco,25300)處理6分鐘;然后,將細(xì)胞懸浮液以300 g離心2分鐘(Ungai Salánki等人,2016)。

Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)ATCC細(xì)胞生物學(xué)收集指南,永生化人類(lèi)T淋巴細(xì)胞系(ATCC;TIB-152)在補(bǔ)充有10%FCS(Sigma)的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。用親脂性熒光染料DiI(100μM,37℃下15分鐘,體外培養(yǎng))對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行染色;然后,以1500 RPM的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。

HT-29細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)ATCC細(xì)胞生物學(xué)收集指南,將HT-29大腸腺癌細(xì)胞系(ATCC;HTB-38)培養(yǎng)在補(bǔ)充有10%FCS的McCoy 5A培養(yǎng)基中。在分選之前,用1×胰/蛋/白酶-EDTA溶液(Gibco,25300)在37℃下處理HT-29細(xì)胞5分鐘;然后,以900 RPM的轉(zhuǎn)速離心細(xì)胞懸浮液5分鐘。

3D打印微孔到皮氏培養(yǎng)皿Cellsorter將高度為1 mm的微型多孔板打印到塑料皮氏培養(yǎng)皿(Greiner)中。Cellsorter使用定制改進(jìn)的商用3D打印機(jī)(Ultimaker)在35 mm皮氏培養(yǎng)皿中打印四個(gè)5×5 mm2正方形的4孔板(Ungai Salánki等人,2016)。

PDMS微孔Cellsorter用聚二甲基硅氧烷(PDMS,Dow Corning Sylgard 184)制備了四個(gè)5×5 mm2微孔,用于模制4孔嵌件。PDMS彈性體和固化劑以10:1的比例混合,并模塑成由聚甲醛(POM)制成的模塑形式。PDMS在室溫下聚合過(guò)夜,并從模塑形式上剝離。Cellsorter將高度為1 mm的PDMS插入物放入疏水培養(yǎng)皿(Greiner)中。

在微孔中創(chuàng)建一薄層細(xì)胞懸浮液,Cellsorter用20μl細(xì)胞培養(yǎng)基覆蓋所有四個(gè)微孔,以濕潤(rùn)疏水性35 mm皮氏培養(yǎng)皿的表面。Cellsorter從孔中取出多余的培養(yǎng)基,用于從中提取細(xì)胞。Cellsorter在皮氏培養(yǎng)皿中加入2毫升礦物油(sigma)。將添加10%FCS的10-15μl培養(yǎng)基中的1500-50000個(gè)細(xì)胞注射到皮氏培養(yǎng)皿中的一個(gè)5×5 mm2微孔中。

從細(xì)胞懸浮液中自動(dòng)分離單細(xì)胞Cellsorter使用自動(dòng)微量移液管裝置(細(xì)胞分選機(jī))(K?rnyei等人2013;Salánki等人2014a)在顯微鏡上檢測(cè)和分離單細(xì)胞。壓電致動(dòng)器(PI陶瓷)控制微移液管的體積。內(nèi)徑為30μm的微移液管被Sigmacote(Sigma-Aldrich)包覆,以避免細(xì)胞粘附在微移液管壁上。Cellsorter將微量移液管插入壓電頭,并用去離子水填充。Cellsorter用微量移液管的尖/端接觸培養(yǎng)皿的表面,以精確校準(zhǔn)其垂直位置(K?rnyei等人,2013)。Cellsorter通過(guò)捕獲覆蓋整個(gè)或部分5×5 mm2的馬賽克圖像來(lái)掃描感興趣區(qū)域。使用CellSorter軟件中實(shí)現(xiàn)的局部方差圖像分割方法,通過(guò)計(jì)算機(jī)視覺(jué)檢測(cè)熒光細(xì)胞。為了優(yōu)化細(xì)胞選擇,可以手動(dòng)調(diào)整檢測(cè)參數(shù)(包括靈敏度、細(xì)胞亮度范圍和細(xì)胞大小)。選擇要分離的細(xì)胞格后,Cellsorter運(yùn)行排序過(guò)程。在提取第一個(gè)細(xì)胞之前,將培養(yǎng)基放入微量移液管中,以避免細(xì)胞的滲透休克。為了實(shí)現(xiàn)精確的細(xì)胞定位,Cellsorter使用自適應(yīng)細(xì)胞定位校正了細(xì)胞坐標(biāo)(Ungai Salánki等人,2016)。為了拾取和沉積單個(gè)細(xì)胞,Cellsorter施加了分別為6伏(100毫秒,線(xiàn)性斜坡)和+30伏(2000毫秒,線(xiàn)性斜坡)。在將細(xì)胞沉積在比Cellsorter用于拾取的體積更大的體積中之后,Cellsorter需要將移液管重置到其初始位置(電壓)。因此,Cellsorter在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基儲(chǔ)存庫(kù)中,通過(guò)應(yīng)用? 24伏(2000毫秒,線(xiàn)性斜坡)。當(dāng)拾取細(xì)胞時(shí),尖/端位于皮氏培養(yǎng)皿表面上方30μm處,當(dāng)將細(xì)胞沉積在貯存器中時(shí),尖/端位于皮氏培養(yǎng)皿表面上方50μm處。沉積區(qū)域選擇在4孔微孔板的第二個(gè)孔中。Cellsorter把第三口井用作水庫(kù)。單細(xì)胞分離的所有步驟均由軟件(CellSorter)*自動(dòng)控制完成。

細(xì)胞活力測(cè)定Cellsorter使用HT-29細(xì)胞量化了單細(xì)胞分離程序?qū)?xì)胞活力的影響。細(xì)胞在新的組織培養(yǎng)皮氏培養(yǎng)皿中沉積并進(jìn)一步培養(yǎng)。分離的細(xì)胞在37°C的5%CO2中培養(yǎng)2小時(shí),然后過(guò)夜。2小時(shí)后,首先通過(guò)計(jì)數(shù)具有正常粘附形態(tài)的細(xì)胞來(lái)檢查存活率。隔夜培養(yǎng)后,更換培養(yǎng)基,并在顯微鏡上計(jì)數(shù)*鋪展的細(xì)胞。如果一個(gè)細(xì)胞在皮氏培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)分裂,它仍然只被算作一個(gè)細(xì)胞。

Cellsorter開(kāi)發(fā)了一種緊湊的壓電微移液管(圖1,補(bǔ)充圖1,2),可以輕松地自動(dòng)化并集成到各種(生物)化學(xué)工作流程中。它消除了塑料管、閥門(mén)、注射器和壓力罐的影響(K?rnyei等人,2013年;Salánki等人,2014a;Ungai Salánki等人,2016年)。 其操作類(lèi)似于滴管或手持移液管。對(duì)于樣品的高質(zhì)量相襯度(Ph1和Ph2)照明,例如細(xì)胞或微小液滴,Cellsorter構(gòu)建了與微移液管同心排列的LED環(huán)。因此,Cellsorter的方法可以*自動(dòng)化使用熒光或相襯照明活細(xì)胞。微移液管(鋒利的玻璃毛細(xì)管)連接到壓電致動(dòng)器。移液管的體積范圍由壓電致動(dòng)器和玻璃微移液管之間的O形圈設(shè)置。Cellsorter采用了各種NBR 70 O型環(huán),包括1×1、3×1、4×1和6×1(內(nèi)徑×高度)mm2尺寸,在1-50 V工作電壓范圍內(nèi),其近似范圍為[0.2-10]、[0.8-40]、[1.2-60]和[2.5-125]nl。壓電致動(dòng)器(圖1b)的膨脹推動(dòng)并變形O形圈,從而減小其內(nèi)部體積(補(bǔ)充圖2)。它導(dǎo)致流體在微移液管中流動(dòng),最后從微移液管流出到皮氏培養(yǎng)皿。當(dāng)壓電致動(dòng)器收縮時(shí),微量移液管從皮氏培養(yǎng)皿中吸出液體。液體處理精度由壓電致動(dòng)器和移液管中的熱波動(dòng)決定。

Cellsorter使用一種簡(jiǎn)單的方法校準(zhǔn)壓電吸管,方法是在顯微鏡上將水注入油環(huán)境中的水珠中(圖1c,d,補(bǔ)充圖3)。Cellsorter通常可以在以下情況下達(dá)到亞納升精度:移液體積在0.5-10 nl范圍內(nèi)(表1)。

Cellsorter使用3.5×1.1 mm2的O形圈將壓電吸管用于nl液滴打印。Cellsorter在油下將水滴打印成網(wǎng)格圖案(圖1e,補(bǔ)充圖4)。液滴的橫向坐標(biāo)由軟件設(shè)定,整個(gè)打印過(guò)程無(wú)需人工干預(yù)。打印nl液滴形成的任何2D圖案都可以以類(lèi)似的方式進(jìn)行。Cellsorter測(cè)量了打印液滴的體積(圖1e,g),并將其與根據(jù)壓電致動(dòng)器的位移(圖1f)計(jì)算的移液管的完整體積變化進(jìn)行比較。壓電位移在0→ + 100→ 0伏航向。Cellsorter可以通過(guò)壓電電壓在10–60 nl范圍內(nèi)控制打印液滴的體積。打印液滴均勻,標(biāo)準(zhǔn)偏差為幾nls(圖1g)。液滴的體積低于計(jì)算得出的吸液全體積,這取決于微吸液管的直徑,因?yàn)樗陀椭g的表面張力。(將水推回移液管的拉普拉斯壓力與移液管直徑成反比。)

Cellsorter使用一個(gè)1×1 mm2的O形環(huán),用熒光微球的粒子跟蹤測(cè)速法定量了微量移液管中流體流動(dòng)的微觀波動(dòng)。熒光微球放在玻璃管內(nèi),末端帶有礦物油塞,以避免蒸發(fā)(圖2a,b)。Cellsorter放下微量移液管,在顯微鏡上觀察微珠的運(yùn)動(dòng)。Cellsorter記錄了珠子的運(yùn)動(dòng)(補(bǔ)充視頻1、2),并使用ImageJ TrackMate軟件插件進(jìn)行分析(www/imagej/net/Getting_start ed_with_Track Mate(圖2c)。Cellsorter在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中跟蹤觀察了約20個(gè)珠子,并計(jì)算了珠子的位移作為時(shí)間的函數(shù)(圖2d)。根據(jù)胎圈位移確定流速和流量(圖2e、f、補(bǔ)充圖5)。峰值的估計(jì)流速為373±29 pl/s,平均體積波動(dòng)率為36±6 pl/s,因此信噪比為10。

Cellsorter使用1×1 mm2 O形環(huán)將壓電吸管用于單細(xì)胞從懸浮液中分離。細(xì)胞被保存在一層薄薄的培養(yǎng)基上,上面覆蓋著油,以盡量減少液體的流動(dòng)和培養(yǎng)基的蒸發(fā)。Cellsorter采用適應(yīng)性細(xì)胞靶向(Ungai Salánki et al.2016)來(lái)利用內(nèi)徑為30μm的微移液管實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)募?xì)胞靶向(圖3a-D)。Cellsorter使用了三個(gè)獨(dú)立的孔:一個(gè)用于拾取,第二個(gè)用于沉積細(xì)胞,第三個(gè)用于重置壓電移液管。Cellsorter施加的電壓為? 6V(100ms,線(xiàn)性斜坡)以拾取體積為1.25±0.48nl的單個(gè)細(xì)胞。Cellsorter可以將單細(xì)胞分離的效率從以前的約75%(Ungai Salánki et al.2016)提高到90%以上,而無(wú)需移除任何相鄰細(xì)胞。3T3、Jurkat和HT-29細(xì)胞的單細(xì)胞拾取效率分別為95±1.2%(n=82)、96±5.8%(n=48)和91±0.8%(n=33)(圖3f-h)。Cellsorter以6 nl的較大體積沉積細(xì)胞,以達(dá)到100%的沉積率(圖3e)。細(xì)胞分選的空間分辨率為29±3.6μm,也就是說(shuō),距離目標(biāo)細(xì)胞較遠(yuǎn)的細(xì)胞未被移除(圖3i,j)。

 

Cellsorter量化了分離的單個(gè)細(xì)胞在分離后2小時(shí)和1天的存活率。分離2小時(shí)后,93±3%的研究(n=30)細(xì)胞存活。隔夜培養(yǎng)后,83±9%的分離細(xì)胞存活。

表1壓電微移液管的校準(zhǔn)

Voltage (V)

?5

+5

?10

+10

?50

+50

Volume (nl)

(mean ± SD)

?0.64±0.38

+0.78±0.35

?1.44±0.56

+1.24± 0.51

?11.05±1.53

+10.31±0.95

Cellsorter通過(guò)在顯微鏡上將水注入(或從)先前沉積在礦物油下的水滴(或從中拉出)作為施加電壓的函數(shù)來(lái)校準(zhǔn)壓電微移液管。當(dāng)正電壓步驟導(dǎo)致注射時(shí),負(fù)電壓步驟將水拉入微量移液管(圖1c,d)。Cellsorter通過(guò)測(cè)量施加電壓前后液滴的直徑和接觸面積的直徑來(lái)計(jì)算液滴體積的變化(補(bǔ)充圖3)。Cellsorter使用了一個(gè)1×1mm2的O形圈

 

圖3單細(xì)胞分離。單細(xì)胞分離前(a)和后(b)的小鼠成纖維細(xì)胞。c、 d放大a、b中虛線(xiàn)框定的區(qū)域。I.d.30μm微移液管的尖/端顯示在a的角/落。/選擇分離的標(biāo)記單元格中的黃色框。紅框中彼此太近的細(xì)胞被軟件排除在外,以避免拾取多個(gè)細(xì)胞。相同位置的框架如b所示。圖像比較表明,即使由于培養(yǎng)皿中的流體對(duì)流,細(xì)胞從初始位置移位,目標(biāo)細(xì)胞也可以很容易地分離出來(lái),而不必拾取紅色框架中的細(xì)胞。整個(gè)隔離過(guò)程可以被跟蹤并保存在實(shí)時(shí)取景攝像機(jī)圖像中,用于回顧和記錄實(shí)驗(yàn)。在e中,選擇24個(gè)單個(gè)Jurkat細(xì)胞分離成網(wǎng)格模式,細(xì)胞之間的距離為500μm。由于拾取#12和#23單元格失敗,網(wǎng)格的相應(yīng)位置為空。在Cellsorter測(cè)試的所有細(xì)胞類(lèi)型中,單細(xì)胞分離f–h的效率都在90%以上。i在微孔中混合50個(gè)熒光細(xì)胞和50000個(gè)未標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域的紅色熒光和相位對(duì)比度圖像的組合圖片。用顯微移液管(如圖角所示)采集熒光細(xì)胞。四個(gè)相鄰的細(xì)胞也被移除,如拾取后拍攝的圖像j所示。通過(guò)測(cè)量靶細(xì)胞中心與最遠(yuǎn)移除細(xì)胞中心之間的距離,Cellsorter計(jì)算了分選的空間分辨率(R):R=29±4μm

Cellsorter開(kāi)發(fā)并校準(zhǔn)了用于納升范圍內(nèi)液體處理的壓電微移液管。移液管的工作原理和幾何形狀非常簡(jiǎn)單。它包含一個(gè)由壓電致動(dòng)器變形的彈性O(shè)形圈(CellSorter Kft(2019)壓電微移液管PCT專(zhuān)/利申請(qǐng)HU 2019/000002)。移液管的體積范圍由O形環(huán)的直徑設(shè)置;因此,通過(guò)更換O型環(huán),相同的裝置可以應(yīng)用于不同的體積范圍。對(duì)微移液管的校準(zhǔn)證明,通過(guò)應(yīng)用~[5–50]V,該裝置可以在[1–10]nl范圍內(nèi)可靠地使用。Cellsorter使用粒子跟蹤測(cè)速儀測(cè)量了微移液管的皮克級(jí)波動(dòng)。平均體積波動(dòng)率為36±6 pl/s,導(dǎo)致信噪比為10。

Cellsorter將該裝置應(yīng)用于油下納米級(jí)水珠打印。Cellsorter可以通過(guò)壓電電壓在[10–60]nl范圍內(nèi)控制打印液滴的體積。打印液滴均勻,標(biāo)準(zhǔn)偏差為幾nls。Cellsorter還將該裝置用于單細(xì)胞分離。它將基于成像的單細(xì)胞分離效率從以前的75%提高到90%以上。這一改進(jìn)在分離稀有或珍貴細(xì)胞時(shí)至關(guān)重要,尤其是在醫(yī)療應(yīng)用中。為了獲得高質(zhì)量的相位對(duì)比成像,Cellsorter構(gòu)建了與微移液管同心排列的LED環(huán)。微移液管可以在顯微鏡上使用熒光或透明照明進(jìn)行全自動(dòng)操作。Cellsorter設(shè)想這項(xiàng)新技術(shù)不久將成為醫(yī)學(xué)診斷中單細(xì)胞操作的標(biāo)準(zhǔn)工具,例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離。

 

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